仔猪水肿病的诊治

减小字体 增大字体 作者:佚名  来源:www.zhonghualunwen.com  发布时间:2009-02-06 09:48:52

 

仔猪水肿病的诊治

是仔猪较为常见的一种急性、致死性疾病,俗称为“红眼病”和“小猪摇摆病”。该病主要发生于断奶仔猪,生长快健壮的仔猪较常见,瘦小的仔猪较少发生。本病发病突然,病程短,死亡快,给养猪户带来了很大的经济损失,是当前发展养猪业的一大障碍。病死猪主要剖检变化为全身淋巴结切面多汁,水肿出血,特别是胃壁水肿,胃大弯和贲门处水肿明显,水肿部位变厚,切面可见肌层和黏膜层之间有无色透明的胶冻样水肿液,胃底弥漫性出血;肺、肝充血水肿;肾包膜增厚水肿;膀胱黏膜轻度出血;胸、腹腔与心包腔以及眼睑、结膜、颜面、颈部等全身多处水肿部位都积有透明的或淡黄色液体,液体在空气中凝结成胶冻状[5]。我们从患病仔猪体内分离出病原菌,对其进行形态和生化鉴定、小鼠致病力试验,鉴定为大肠杆菌。并用红霉素、四环素、庆大霉素、头孢他定等14种抗生素对分离的细菌进行了药敏试验。鉴于本病以上和治愈率低的特点,我们利用分离培养的细菌进行增殖培养,并自制了生理盐水菌液和营养肉汤菌液两种灭活疫苗。结果表明菌种在普通琼脂斜面上生长旺盛,两种疫苗安检小鼠全部健活,效力检验生理盐水和营养肉汤菌液组免疫保护率分别达到75%87.5%。并且灭活疫苗制备工艺简单,切实可行,疫苗安全性好,保护性强,值得进一步研究。现将我们的结果报告如下:

1材料和方法

1.1 患病猪  由莱阳某养猪场提供

1.2 培养基  普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、SS琼脂和三糖铁琼脂:购自杭州天和微生物试剂有限公司;营养肉汤培养基、吲哚、甲基红和枸橼酸盐利用实验培养基自行配制。

1.3生化试验管  葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、尿素、木糖、麦芽糖、卫矛醇、七叶苷:购自杭州天和微生物试剂有限公司

1.4 药敏试纸  红霉素(E)、四环素(TE)、庆大霉素(GM)、头孢唑啉(CZ)、头孢他定(CAZ)、万古霉素(VA)、青霉素(P)、丁胺卡那(AN)、苯唑西林(OX)、呋喃妥因(FM)、氨苄青霉素(AM)、头孢哌酮(CFP)、阿莫西林(AMC)、环丙沙星(CIP):均购自杭州天和微生物试剂有限公司

1.5 动物  健康小白鼠.

2. 实验方法

2.1 病原的分离和鉴定

2.1.1 取病死仔猪肝脏和肠系膜淋巴结于普通营养琼脂、鲜血琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂和SS营养琼脂平板上分离,37.8  24h培养后,选择麦康凯呈红色和典型溶血性菌落鉴定。

2.1.2 病原的涂片镜检 取病死仔猪肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结涂片,革蓝氏和美蓝染色镜检,取细菌培养菌落用生理盐水稀释后涂片,革兰氏和美蓝染色镜检。

2.2 生化反应  将初选的可疑菌落纯化后分别接种于三糖铁琼脂和枸橼酸盐利用实验培养基,吲哚、甲基红、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、尿素反应管内,37反应48-72h。凡符合于大肠杆菌属定义者留作抗原鉴定和致病性试验[2]

2.3 小鼠攻毒试验  取血琼脂上溶血菌落用生理盐水溶解,测得其浓度为16亿/ml,用生理盐水稀释为1.6亿/ml供攻毒试验用。实验组小鼠三只,每只腹腔注射0.1ml菌液,对照组三只,每只腹腔注射0.1/ml生理盐水,观察7d,取死亡小鼠的肝脏和脾脏涂片染色镜检,并涂布于普通营养琼脂,血琼脂和麦康凯琼脂平板上,37培养24h[7]

2.4 菌种增殖  取麦康凯上呈红色和典型的溶血菌落,接种于普通琼脂斜面37培养18-24h4冰箱保存,作为一级种子备用。

2.5 药敏试验  用灭菌棉试子沾取待检细菌6h培养物,均匀地涂布在营养琼脂平板上,然后夹取各种药物纸片,按一定间隔贴放到琼脂培养基的表面,置37.8温箱内,培养18h,观察抑菌圈直径大小。

2.6 灭活苗的制备

2.6.1 抗原液的制备  生理盐水菌液组 取一级种子接种于普通琼脂平板中,37培养18-24h,用灭菌生理盐水洗下菌苔并混合。

营养肉汤菌液组 取一级种子分别接种于营养肉汤中,37.8培养18-24h,做纯度检验。

2.6.2 纯度检验和活菌计数  抗原液制备完成后,取样用普通琼脂做纯度检验,同时进行活菌计数。

2.6.3 灭活  抗原液按量加入0.3%甲醛溶液,于37.8振荡培养箱中培养48h 

2.7 疫苗的检验 

2.7.1性状检查

 生理盐水菌液组  疫苗静止后,下层有少许沉淀,上层为半透明液体,摇动后沉淀悬浮,呈均质白色混悬液。

营养肉汤菌液组  疫苗呈棕黄色半透明液体。

2.7.2无菌检验  随机抽检样品,分别接种于普通营养琼脂斜面,鲜血琼脂板37培养48h,检查无细菌生长。⑴

2.7.3 安全检验  注射疫苗后,观察7天,应正常方可使用,实验设计见下表。

                      1安全检验试验设计

组别       注射部位       注射量(ml    小鼠(只)

生理盐水菌液组    肌肉/皮下      0.2/0.2  3/3

营养肉汤菌液组    肌肉/皮下      0.2/0.2    3/3

2.7.4效力检验  20只小鼠,10只每只腹腔注射生理盐水菌液灭活苗0.2ml,另10只每只腹腔注射营养肉汤菌液灭活苗0.2ml,免疫14d后,连同另10只未免疫对照小鼠每只腹腔注射强毒菌液0.1ml1.6亿/ml,继续观察10-14d[6]

3结果

3 病原菌的分离  结果见表2

                  2病原菌分离结果

培养基    菌落特征             

普通营养琼脂       光滑、灰白、湿润、圆形边缘整齐稍隆起的小菌落             

血琼脂平板    有明显的β溶血环             

麦康凯琼脂    光滑、湿润、红色圆形菌落             

伊红美蓝琼脂       紫黑色带金属光泽的圆形菌落          

SS琼脂  红色的中等大小的菌落             

制片染色镜检为典型的G-球杆菌。

3.2 常规生化鉴定结果  结果见表3

                  3大肠杆菌生化鉴别结果

培养液(基)       反应结果       培养液(基)       反应结果                           

三糖铁    +     鼠李糖    +                         

枸橼酸盐利用试验       -      蔗糖       -                          

H2S    -      甘露醇                            

吲哚       +     山梨醇    +                         

甲基红    +     七叶苷    -                          

葡萄糖        卫矛醇    -                          

乳糖       +     尿素       -                          

木糖       +     麦芽糖    +                         

注: :⊕产酸产气,培养液(基)变颜色,并有气泡产生;-无变化,培养液(基)仍为原色;+培养液(基)变颜色。由表3结果可见,可疑菌的生化反应特性均符合大肠埃希氏菌属定义,属于溶血性大肠杆菌。

3.3小鼠攻毒试验结果  实验组小鼠第5天时全部死亡,对照组健康无异常。3.4药敏试验结果  应用纸片法对致病性很强的分离菌进行了14种抗菌药物的敏感实验,结果见表4                   

 4 药敏试验结果

Table4 The antibiotics sensitivity testing of E.coli

抗生素Antibiotics  抑菌圈直径(mmDia of antibiorobial      结果判定analysis of result                 

丁胺卡那       30    高敏                    

头孢哌酮       28    高敏                    

头孢他定       27    高敏                    

头孢唑啉       22    高敏                    

呋喃妥因       17    中敏                    

阿莫西林       15    中敏                    

庆大霉素       12    低敏                    

四环素    10    低敏                    

红霉素    0     耐药                    

万古霉素       0     耐药                    

青霉素    0     耐药                    

苯唑西林       0     耐药                    

氨苄青霉素    0     耐药                    

环丙沙星       0     耐药                    

注:抑菌圈直径>20mm为高敏;15-20mm为中敏;<15mm为低敏;0为耐药[3.4]

4结果表明,该菌对丁胺卡那、头孢哌酮、头孢他定、头孢唑啉高度敏感,对呋喃妥因、阿莫西林中度敏感,对四环素、庆大霉素低度敏感,对红霉素、万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄青霉素、环丙沙星不敏感。

3.5疫苗检验

3.5.1无菌检验   随机抽检样品,用普通琼脂斜面,血琼脂板做无菌检验,结果无菌生长。

3.5.2安全检验  12只小鼠将两种灭活疫苗分别肌肉和皮下注射免疫7天后,均健康存活,无局部和全身反应。

3.5.3效力检验  试验结果见表5

                    5灭活疫苗效力检验结果  

内容/组别      生理盐水灭活疫苗       营养肉汤灭活疫苗       对照组          

接种小鼠量(只)       10       10       10             

免疫量(ml       .      .                

攻毒量/108    0.1      0.1      0.1            

发病小鼠量(只)               10             

死亡小鼠量(只)                         

发病率(% 30       20       100          

死亡率(%)       66.   50       80             

免疫保护率(%)       75       87.                

免疫保护率=(对照组死亡数-试验组死亡数)/对照组死亡数×

100%

4分析和讨论

近年来随着养猪业的发展,仔猪水肿病的发生日趋严重。本病发病率虽不高,但死亡率可达90%以上,给养猪业带来很大的危害,因此早期预防是关键。但由于仔住水肿病的血清型不同,且不同的血清型之间无交叉保护性,所以为了更好地预防本病就必须制备仔猪水肿病自家灭活苗,进行仔猪水肿病的防治。一旦有本病发生,要进行药敏试验及时投喂最有效的抗生素,以尽快控制本病。本实验通过观察临床症状、剖检变化,从病死猪肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结分离出病原,再通过一系列的试验,鉴定为溶血性大肠杆菌,得到细菌的纯培养物,但由于实验条件限制未得到致病菌的血清性。通过纸片法药敏试验,表明该菌对头孢均素类抗生素和丁胺卡那高度敏感。而对常规的治疗革兰氏阴性菌的抗生素如庆大霉素、四环素等则表现为高度或底度的敏感,说明本病原菌产生了一定的耐药性,不能用传统的抗革兰氏阴性菌的抗生素来治疗。所以一旦有本病发生必须要做药敏试验。由于增菌培养过程中很容易受到形态相似的巴氏杆菌的污染,所以,为避免不必要的浪费,在每一步的增菌过程中必须对每一份的培养物同时进行简单的纯粹检验,染色镜检为纯的革兰氏阴性杆菌,然后再进行下一步的增菌培养,最后制的了灭活疫苗。经试验证实,两种疫苗按2倍预防剂量,通过不同注射部位对小鼠进行安全试验,接种后未见不良反应,证明两种疫苗安全性好。用疫苗常规量0.ml/只分别免疫小鼠14天后连同对照组小鼠每只腹腔注射强度菌液,观察14天后,两种疫苗的免疫保护率都在75%以上,说明两种疫苗的免疫保护效果都很好。疫苗必须在自然平衡至室温时使用。并且有文献报道,为了提高免疫效果,可在灭活后加等量的氢氧化铝或蜂胶佐剂,制成蜂胶灭活苗。

5结论

根据上述研究结果,初步认为,莱阳市某养猪场仔猪水肿病的发生是由致病性溶血性大肠杆菌引起的。从药物敏感试验结果和灭活疫苗的效力试验结果看,当猪发生本病时,如能给病猪投放头孢菌素类、丁胺卡那等抗生素,同时给其他仔猪注射自制的灭活疫苗能有效地防治本病。

6致谢

本试验在孙月平老师的悉心指导下,在莱阳农学院动物科技学院化验中心完成的。另外刘慧芳同学在实验中也提供了很大的帮助,在此向他们表示我诚挚的感谢。

参考文献

[1]张振新,姜平.实用兽医生物制品技术[M]北京:中国农业科技出版社,1996.

[2]甘肃农业大学,兽医微生物实验指导[M].北京:中国农业出版社 199981-87.

[3]N.O.Niel Sen Disease of Swine  1981.

[4]Harold .Am.J.Vet,Res  1976  37 No1 15-24.

[5]于书敏,宁章勇,等.仔猪水肿病的研究进展[J].动物科学与动物医学,2003203):18-19.

[6]李鹏,王家乡,等.仔猪水肿病蜂胶佐剂多价灭活苗的研制[J].动物医学进展,2004252):93-94.

[7]姜永康,王桂芳,等.疑似仔猪水肿病的病原分离鉴定和药物敏感试验[J].四川畜牧兽医,1996125-27.

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