间充质干细胞与神经干细胞序贯移植修复大鼠脊髓损伤的作用

减小字体 增大字体 作者:佚名  来源:本站整理  发布时间:2017-10-12 08:29:53

1 材料与方法 
  1.1实验材料 
  实验所用SPF大鼠均由安徽医科大学动物实验中心提供,4 w雌性大鼠5只,SPF级,重(100 ±10)g;新生大鼠5只,SPF级;成年雌性大鼠48只,SPF级,重(230±20)g。主要试剂与仪器:胎牛血清FBS(美国Gibco公司);慢病毒载体(上海吉凯基因公司);B-27(美国Invitrogen公司);CO2恒温培养箱(日本三洋)。 
  1.2实验方法 
  1.2.1 大鼠NSCs的培养、转染、鉴定 新生SPF级大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛),剪刀离断头颅,75%酒精浸泡5 min,紫外线照射30 min,取大鼠全脑,Hank's液漂洗三次,剪碎全脑,加入神经元基础培养基5 ml,加入胰酶细胞消化液1 ml,消化5 min,加入10%胎牛血清培养基终止消化;70 μm孔径的筛网过滤,制成单细胞悬液,1000 r/min离心10 min,弃上清液, 反复吹打单细胞悬液,加入2 ml无血清培养基 (含有 DMEM/F-12 + 2 %B-27 + 20 ng/mlEGF + 20 ng/mlbFGF + 青霉素100 U/ml + 链霉素0.1 mg/ml),1000 r/min离心3 min,弃上清液, 加入无血清培养基,吹打单细胞悬液,计数。将单细胞悬液以1×106/ ml接种于25 cm2培养瓶中,恒温培养箱(37 ℃、5%CO2)培养, 每3 d换液1次。2~3 d后镜下观察,可见悬浮生长的细胞球,7 d后,600 r/min离心5 min,吸弃上清液,加入新鲜培养基,长颈吸管反复吹打细胞球,制成单细胞悬液,分别接种到两个新培养瓶中,1×105个细胞/瓶,培养条件不变。每3 d换液1次,每7 d传代1次。提取2瓶传代培养三代的NSCs,分别倒入两只25 ml试管中,3000 r/min离心5 min,吸弃上清液,将细胞沉淀接种于6孔板上(接种体积2 ml+病毒量160 μl+ENi.S.液160 μl)。经转染后的神经干细胞继续置入37 ℃、5 %CO2恒温培养箱中培养,,每3 d换液1次。神经干细胞培养7 d后镜下观察转染后神经干细胞的分化情况。 
  1.2.2 大鼠BMSCs的培养与鉴定 取4 w左右SPF级大鼠的双侧下肢骨,打开骨髓腔,10 ml培养液(含1万U肝素)冲洗,加入3 ml Ficoll-Paque分离液,梯度离心,吸取中间界面层,PBS液冲洗3次,制成单细胞悬液,接种于aMEM培养基(含有10%FBS,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素),置于恒温培养箱(37 ℃、5 %CO2),每3 d换液1次,去除未贴壁细胞,至细胞融合时胰蛋白酶消化收集,传代并检测CD29,CD34,CD90。 
  1.2.3 大鼠SCI模型的创建、分组及序贯移植治疗 实验所用器械、场地均由安徽医科大学动物实验中心提供,取250 g左右的SPF级大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露胸9脊髓(见图1),采用改良的Allen装置制作大鼠脊髓损伤模型。脊髓损伤局部明胶海绵填塞止血,常规肌肉、筋膜、表皮3层缝合。术后3 d每天予青霉素(50000 U/Kg)在大腿处肌注。每6 h人工辅助排小便1次直至恢复自主排便。将48只脊髓损伤大鼠随机分配为对照组和实验组,每组各24只,分笼饲养,实验大鼠出现死亡后以同样标准再次建模递补。序贯移植治疗:对照组(标记神经干细胞移植组,A组,24只):T9脊髓损伤后3 d经尾静脉注射含单细胞浓度为1×106/ml的POLY-M慢病毒转染后的NSCs条件培养液2 ml;实验组(序贯移植组,B组,24只):T9脊髓损伤后1 d经尾静脉注射含单细胞浓度为1×106/ml的BMSCs条件培养液1ml,脊髓损伤后3d经尾静脉注射含单细胞浓度为2×106/ml的POLY-M慢病毒转染后的NSCs条件培养液1 ml。 

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